□ 1차년도: 3차원 배양 조건 및 preconditioning에 따른 인간제대혈 및 설치류 골수 유래 MSC 엑소좀의 시험관 내 효능 비교1) MSC 3차원 배양 조건의 최적화; cell density (2.5k, 6.25k, 25k, 50k cells, hanging drop culture), culture period (0h, 24h, 48h, 72h, 96h), cytokine priming (IFN-γ 10, 20, 40ng/mL, TNF-α 10, 20, 40ng/mL and/or 3ng/ml IL-1β for 24h), hypoxia의 조합으로 배양 후 exosome isolation/characterization (exosome marker 존재 및 크기, 세포내 단백 부재 확인), analysis of exosomal cargo2) heterozygote human islet amyloid polypeptide (hIAPP) transgenic mice islets의 시험관 내 배양 (cytokines, high glucose, and/or palmitate로 dedifferentiation, stress 유도) 시 2차원 및 3차원 배양 MSC 엑소좀을 투여 후 대조군과 아래 사항을 비교- β-cell dedifferentiation markers, β-cell apoptosis/death, islet function, composition, hIAPP oligomer, inflammasome activation (NLRP3, caspase-1 activity, IL-1β, IL-18), TNF-α - 배지 내 chemokines (CCL2, CCL3, CXCL1, CXCL2, CXCL10)- bone marrow-derived macrophage 및 THP-1 cell chemotactic index3) hepatocyte cell lines (HepG, L-02 cells)의 시험관 내 배양 (LPS, palmitate 순차적 추가로 inflammasome activation) 시 2차원 및 3차원 배양 MSC 엑소좀을 투여 후 대조군과 아래 사항을 비교 - inflammasome activation, TNF-α - insulin resistance 평가; p-IRS (Ser307), IRS, PI3K, p-AKT (Thr308), AKT, Glut4 translocation, AMPK [with and without insulin]□ 2차년도: 제2형 당뇨병 설치류 모델에서 3차원 배양 MSC 엑소좀 정맥 내 투여의 베타 세포 역분화 및 세포 사멸 억제 효과 평가1) hIAPP 발현/고지방 식이 제2형 당뇨병 설치류 모델 확립 - male hIAPP homozygous transgenic mouse에 high fat diet를 투여, 인간 제2형 당뇨병 병태생리와 유사한 베타세포 기능 저하와 인슐린 저항성을 유도)- 베타세포의 가역적 역분화 상태로 기대되는 6~8주에 3D MSC를 투여하는 모델과, islet composition의 변화, 섬유화가 이미 나타난 20주에 투여하는 모델에서 각각 검증 - 시기 별 insulin secretory reserve 평가 (glucose tolerance test)2) Pancreatic islet histology; Islet composition (β-cell area, α-, δ-cell area, insulin contents), β-cell dedifferentiation/apoptosis markers, NLRP3, IL-1β, IL-18, TNF-α, hIAPP oligomer/amyloid deposit, fibrosis, macrophage infiltration/polarization markers 3) bone marrow-derived macrophage을 M1 polarization 조건에서 배양 시 각 조건 별 3차원 배양 MSC 엑소좀 투여 후 M1/M2 marker 및 cytokine 발현 비교□ 3차년도: 제2형 당뇨병 설치류 모델 (male hIAPP homozygous transgenic mouse + high fat diet)에서 3D MSC 엑소좀 정맥 내 투여의 염증 반응 감소 및 인슐린 저항성 개선 효과 평가 1) Liver/muscle/adipose histology; NLRP3, p-IRS (Ser307), IRS, PI3K, p-AKT (Thr308), AKT, and Glut4 translocation, AMPK [insulin 투여 전후의 변화 비교]2) Islet/liver(Kupffer cell)/adipose macrophage infiltration (F4/80)/polarization markers (CD11c, iNOS, Fizz1, CD206, CD163, ARG1)3) epididymal fat pad 및 spleen의 Foxp3+ regulatory T cell 4) systemic inflammation (IL-1β, TNF-α, IL-6), indices of systemic insulin resistance and secretion
